La détection moléculaire de pathogènes d’origine hydrique : Cryptosporidium parvum

Chercheurs principaux - Hung Lee, professeur, Université de Guelph, et Jack Trevors, professeur, Université de Guelph (2001-2004)

Enjeu

Le Cryptosporidium parvum est un parasite intestinal qui frappe les êtres humains et d’autres mammifères, notamment diverses espèces d’animaux d’élevage, dont les veaux et les agneaux. Après s’être propagés dans les intestins des animaux infectés, les parasites se transmettent à de nouveaux hôtes par le biais de spores durs du nom d’oocystes. Couramment présents dans les matières fécales, les oocystes se transmettent souvent par le biais de l’eau. Par exemple, la présence de C. parvum dans les réserves d’eau résulte souvent, pense-t-on, d’une contamination fécale d’origine humaine ou animale. Toutefois, comme la relation entre la prévalence des infections, l’incidence des maladies et la quantité d’oocystes n’est pas encore bien comprise, l’importance de la présence d’un petit nombre d’oocystes dans l’eau potable reste à déterminer.

L’évaluation de la menace posée par le Cryptosporidium d’origine hydrique est compliquée par la nature dynamique du parasite proprement dit. Même lorsqu’on détecte des oocystes dans l’eau potable, il est difficile d’en déterminer la source, la viabilité et l’infectiosité pour les êtres humains. D’autres recherches seront nécessaires pour concevoir des méthodes sensibles permettant de quantifier le nombre d’oocystes présents dans l’eau potable afin d’établir un seuil d’intervention relatif au Cryptosporidium.

Dans le cadre de ce projet, les recherches ont porté sur le développement et l’évaluation de nouvelles méthodes de détection et de détermination de la viabilité et de l’infectiosité des oocystes, un tout essentiel à l’évaluation de la présence, de la prévalence et de l’infectiosité de pathogènes dans les approvisionnements en eau municipale.

Projet

Le développement de meilleures méthodes de détection du C. parvum mettait en jeu deux domaines de recherche principaux. Le premier avait pour but de mettre au point une méthode visant à déterminer la viabilité et l’infectiosité des oocystes tandis que la seconde faisait appel à l’élaboration d’anticorps recombinants particuliers contre le C. parvum.

Afin d’atteindre le premier objectif, l’équipe a employé une technique spécialisée de réaction de polymérase en chaîne-nombre le plus probable (RCP-NPP). En biologie moléculaire, la RCP sert à amplifier, de plusieurs ordres de grandeur, une séquence d’ADN particulière. Avec la technique RCP-NPP, des matrices d’ADN d’oocystes de C. parvum ont été diluées en série avant les réactions RCP. Cependant, les réactions ne pouvaient se produire qu’en présence d’une matrice, ce qui permettait aux chercheurs d’évaluer la concentration originale des molécules de la matrice.

Le second objectif faisait appel à l’utilisation d’anticorps recombinants qui ont été développés pour la première fois entre le milieu et la fin des années 1980 en tant que méthode révolutionnaire de sélection d’anticorps particuliers pour les résidus antimicrobiens et d’autres antigènes. Les chercheurs ont élaboré des anticorps recombinants contre les oocystes de C. parvum en adoptant l’approche suivante :

1. Immuniser des souris et des lapins avec des oocystes de C. parvum
2. Produire des banques d’anticorps afin de faciliter le dépistage
3. Passer au crible les banques d’anticorps en vue d’y sélectionner les deux à quatre meilleurs clones de liaison pour en réaliser la caractérisation
4. Exprimer les clones sélectionnés

Cette approche a permis aux chercheurs d’obtenir deux clones capables d’empêcher toute infection par les oocystes de C. parvum, quoique, s’ils étaient présents en nombre élevé, les anticorps recombinants semblaient entrer en réaction croisée avec plusieurs autres micro-organismes.

Produits

• Des méthodes permettant de déterminer la viabilité et l’infectiosité du C. parvum ont été directement transmises aux partenaires de recherche des secteurs industriel et gouvernemental afin qu’elles soient utilisées dans des programmes de veille réglementaire, de recherche ou d’exploitation commerciale.
• Il existe des possibilités de breveter les technologies novatrices issues du projet, notamment les nouveaux anticorps recombinants qui peuvent servir à assurer la surveillance régulière du C. parvum dans les eaux municipales.

Le projet a également donné lieu à plusieurs publications dont voici une liste choisie :

Articles évalués par les pairs

Pokorny, N.J., S.C. Weir, R.A. Carreno, J.T. Trevors et H. Lee (2002) “Influence of temperature on Cryptosporidium parvum oocyst infectivity in river water samples as detected by tissue culture assay.” Journal of Parasitology 88, 641-643.

Weir, S.C., N.J. Pokorny, R.A. Carreno, J.T. Trevors et H. Lee (2002) “Efficacy of common laboratory disinfectants on the infectivity of Cryptosporidium parvum oocysts in cell culture.” Applied and Environmental Microbiology 68, 2576-2579.

Yau, K.Y.F., H. Lee et J.C. Hall (2003) “Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies.” Biotechnology Advances 21, 599-637.

Carey, C.M., H. Lee et J.T. Trevors (2004) “Biology, persistence and detection of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium hominis isolates.” Water Research38, 818-862.

Résumés

Lee, H., J.T. Trevors et J.C. Hall (2003) “Molecular-based detection of Cryptosporidium parvum.” Présentation orale (donnée par N. Pokorny) à l’assemblée annuelle du Réseau canadien de l’eau. 23-27 mars (Saint John, Nouveau-Brunswick).

Carey, C.M., L. England, N. Pokorny, N. Wilson, S.C. Weir, J.T. Trevors et H. Lee (2003) A most probable number (MPN) PCR method for the environmental detection of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium hominis. Affiche présentée à l’assemblée annuelle du Réseau canadien de l’eau. 23-27 mars (Saint John, Nouveau-Brunswick).

Pokorny, N.J., J. Boulter, J.C. Hall, H. Lee et J.T. Trevors (2003) Construction of recombinant antibodies to Cryptosporidium parvum. Affiche présentée à l’assemblée annuelle du Réseau canadien de l’eau. 23-27 mars (Saint John, Nouveau-Brunswick).

Résultats

• Accroissement des connaissances relatives à l’évaluation de la présence, de la prévalence et de l’infectiosité des pathogènes dans les réserves d’eau municipales.
• Le développement de méthodes sensibles, rapides et rentables de détection de pathogènes d’origine hydrique importants comme le C. parvum dans les eaux superficielles et souterraines permettra de protéger les réserves d’eau potable et la population contre d’éventuelles contaminations, ce qui améliorera, à long terme, la santé publique et le bien-être social.
• Comme les anticorps pour le C. parvum actuellement offerts sur le marché manquent généralement de spécificité, les anticorps recombinants mis au point ont de grandes chances de pouvoir être brevetés pour leur emploi dans les analyses d’eau. Les anticorps recombinants peuvent également servir à purifier les oocystes dans les échantillons d’eau environnementale et à élaborer des applications immunothérapeutiques.